单碱基点突变是人类遗传病发生的重要诱因【1】，因此高效精准的单碱基编辑技术对人类遗传病的机制研究及基因治疗探索有非常重要的意义，也是基因编辑研究领域非常具有挑战性的方向。2016年以来，哈佛大学David Liu实验室将碱基脱氨基酶与CRISPR-Cas9系统有机组合，开发出了一系列高效精准的单碱基编辑技术---碱基编辑器CBE和ABE。其中以胞嘧啶脱氨基酶AID/APOBEC为核心、可实现C·G--T·A碱基对高效转换的是胞嘧啶碱基编辑器（CBE）；以蛋白定向演化后的腺嘌呤脱氨酶TadA为核心、可实现A·T--G·C碱基对高效转换的是腺嘌呤碱基编辑器（ABE）【2-3】。CBE和ABE的出现有力推动了人类遗传病的机制和治疗研究，也让碱基编辑器研发吸引了众多研究者的关注。

碱基脱氨基酶是碱基编辑器的核心组分之一。CBE开发过程中研究者发现，不同物种来源的胞嘧啶脱氨基酶对CBE的碱基编辑活性、活性窗口、碱基偏好性以及脱靶效应均有重要的影响【4-5】。这提示我们，脱氨基酶同源蛋白筛选是开发具有独特编辑特性的碱基编辑器，扩展并丰富碱基编辑工具包的重要策略。然而ABE开发过程中研究者发现，野生型腺嘌呤脱氨基酶无法用于功能性ABE的构建，现有ABE及其衍生工具的脱氨基酶均是以大肠杆菌TadA（ecTadA）为基础通过多轮蛋白定向演化后获得的各类突变体。由于ecTadA的定向演化及蛋白质工程化改造过程非常复杂，且需要引入十余种不同点突变方能获得活性较高的ABE，因此还未有研究尝试探索其它物种来源的TadA同源蛋白在碱基编辑器开发中的潜力。

复旦大学程田林团队长期关注碱基编辑器的开发与优化研究。团队在前期研究中曾对胞嘧啶脱氨基酶同源蛋白进行系统性筛选，开发出一系列具有多样化活性窗口和低脱靶效应的CBEs（Nat Comm | 仇子龙组开发出新型单碱基编辑器，拓展C/G-T/A单碱基编辑适用范围 ）【4】。研究团队还证实nCas9的内部融合可增强碱基编辑器ABE的编辑活性并拓展活性窗口（Nat Comm | 程田林/仇子龙/王小林课题组合作推动单碱基编辑工具ABE的协同优化 【6】。团队在前期研究的基础上，通过对数十种TadA同源蛋白进行系统性的改造与筛选，发现有25种TadA同源蛋白可通过单/双点突变改造构建出功能性的ABE、CBE或ACBEs。相关研究成果以TadA orthologs enable both cytosine and adenine editing of base editors为题在Nature Communications杂志上发表。

本研究中程田林团队发现，大肠杆菌来源的野生型ecTadA添加5’-NLS和3’-柔性接头序列（简写为N L- ec T adA）并融合于nCas9内部的DS1249位点后，仅通过A106V和D108N双点突变（ec T ad A （V N ））便可获得具有明显腺嘌呤和胞嘧啶编辑活性的功能性碱基编辑器1249-NL-ecTadA（VN），其A5的A-G突变率为83%，C4的C-T突变率为27% （图1）。

图1 内部融合策略与ecTadA双点突变组合构建功能性碱基编辑器及编辑效率分析 

在此基础上，研究团队对近千种TadA同源蛋白进行了系统进化树分析，并挑选超过50种TadA同源蛋白通过内部DS1249位点融合进行功能筛选。结果发现有25种TadA同源蛋白可通过单/双点突变改造生成功能性的ABEs、CBEs和ACBEs，其中9种主要表现为ABE活性，9种具有明显的ABE和CBE的活性，7种主要表现为CBE活性（图2）。随后研究团队挑选数种有代表性的TadA同源蛋白衍生碱基编辑器进行安全性评估，发现其Cas9非依赖的DNA脱靶效应极低，而RNA脱靶效应通过合理的点突变设计后有明显降低甚至接近本底水平。

图 2  TadA同源蛋白改造用于功能性ABEs、CBEs和ACBEs的构建  

最后，研究团队综合已有研究结果，对腺嘌呤和胞嘧啶脱氨基酶的底物特异性进行了汇总，并对脱氨基酶潜在的演化关系进行了分析（图3）。本文的研究结果提示，胞嘧啶脱氨基酶AID/APOBEC蛋白家族很可能是从腺嘌呤脱氨基酶TadA演化而来：脱氨基酶的底物特异性演化路径很可能是从RNA的腺嘌呤脱氨酶活性向DNA的胞嘧啶脱氨酶活性再向RNA的胞嘧啶脱氨酶活性依次推进。

                                           图3 腺嘌呤和胞嘧啶脱氨酶的潜在演化关系分析 

总体而言，程田林研究团队提供了TadA同源蛋白通过简单蛋白质工程化改造（单/双点突变）用于碱基编辑器开发的新思路，并证实了TadA同源蛋白用于包括ABE、CBE以及ACBE在内的各类碱基编辑器开发的可行性。该研究为碱基编辑器的开发提供了一种新的替代和简化策略，这对于开发具有独特编辑特性的碱基编辑器有非常重要的指导意义，也为脱氨基酶的演化研究提供了重要的信息。

复旦大学脑科学转化研究院程田林实验室的张淑倩博士、中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）袁博博士为该研究论文的共同第一作者。复旦大学脑科学转化研究院陈金龙博士、邱佳怡，复旦大学类脑智能科学与技术研究院曹际新、宋利婷博士对本研究亦有重要贡献。本项目得到了复旦大学类脑智能科学与技术研究院赵兴明教授、陈靖祺博士，以及中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）仇子龙研究员的大力支持。该研究在国家重点研发计划、国家自然科学基金、“求索”杰出青年计划、临港实验室、上海市科技重大项目和上海市自然科学基金的资助和支持下完成。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-36003-3

参考文献： 

1.Rees HA, Liu DR. Base editing: Precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet,2018, 19: 770-788

2.  Komor, A., Kim, Y., Packer, M. et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016). 

3.  Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).

4.  Cheng, T. L. et al. ExpandingC-T base editing toolkitwith diversified cytidine deaminases. Nat. Commun. 10, 3612 (2019).

5.  Yu, Y. et al. Cytosine base editors with minimized unguided DNA and RNA off-target events and high on-target activity. Nat. Commun. 11, 2052 (2020).  

6.Li, S. et al. Docking sites inside Cas9 for adenine base editing diversification and RNA off-target elimination. Nat. Commun. 11, 5827 (2020).