蛋白质的功能由其三维结构决定——这是结构生物学的基本信条。然而，从想要的功能出发，反向定制一个自然界中不存在的蛋白质，却远比顺向推理困难得多。前AI时代的研究者们难以跨越序列、结构到功能的规律黑箱，而以RFdiffusion为代表的深度学习模型为这道鸿沟铺上了一座新的桥梁。以靶蛋白表位为基准，RFdiffusion通过扩散生成模型，由自发幻觉根据蛋白质折叠规则逐步收敛，生成全新的结合蛋白骨架，搭配序列设计算法与结构预测，在设计蛋白的速度与准确性上都取得了瞩目的突破。自此，AI蛋白质设计真正进入了实用化阶段，领域研究的核心问题也逐渐从“能不能设计出稳定折叠的结合蛋白”转向“如何在复杂靶点上实现功能性设计”。

G蛋白偶联受体（GPCR）是人类基因组中最大、最多样化的膜受体家族，参与从视觉、嗅觉到代谢、情绪等几乎全部生理过程的调控，因而成为药物调控的“黄金靶点”。然而，对GPCR功能的精准调控依赖对构象的选择性锁定，而正构调节位点处于螺旋口袋较深处，一般的表位结合配体难以完全触及；抗体工程等传统设计方法往往难以兼顾设计精度和功能有效性，还需要更适配的计算策略和配套的高通量筛选技术验证。因此，对GPCR的特异调节剂设计成为蛋白质设计的攻关热门问题。

华盛顿大学David Baker团队于2026年5月21日在《Nature》上发表了题为 De novo design of miniproteins targeting GPCRs的文章，充分展示了AI辅助蛋白质从头设计在复杂药物靶点上的优秀应用潜力。作者团队针对性开发了专门针对GPCR深藏功能性表位的计算设计方法，搭配自主搭建的高通量筛选平台OPS-RD完成技术验证，成功实现了多个GPCR靶点的高亲和力结合剂设计，为靶向GPCR的全新生物药物开发开辟了新的路径。

GPCR靶向调节蛋白的设计策略

GPCR的正构结合位点处于跨膜螺旋形成的凹陷空腔中，要求结合蛋白形成相应的凸起三维补形紧密结合，对从头设计的形状精确度及骨架稳定性形成了较大挑战。

因此，David团队针对性开发了两种设计策略：一条路线对Rfdiffusion的设计区间做出“两步法”调整，首先针对结合位点空腔生成5个氨基酸残基的短肽，取高亲和力肽段进一步补全完整蛋白质骨架，最后通过优化的迭代部分扩散方法，以有潜力的结合蛋白设计为蓝本批量生成变体以扩展候选文库。

另一方面，对天然蛋白的参考有助于突破人工设计蛋白在骨架模体选择和组合上的多样性局限。为此研究人员开发了MetaGen文库，该库由Alphafold2预测中取得高置信度的、含有helix-turn-helix或β发夹环等凸起元件的天然蛋白质构成，通过Rosetta Rifdock将库与靶蛋白位点批量对接筛选，并对入选蛋白使用ProteinMPNN重新设计复数个序列以生成候选蛋白。

图1.GPCR结合蛋白设计与筛选路线

为适应大文库的高通量筛选需要，作者团队开发了基于受体分选的光学池成像筛选（optical pooled screening-receptor diverting, OPS-RD）技术：稳转细胞系表达携代GFP荧光标签的特定靶受体，过表达的待筛选结合蛋白与内质网驻留信号（KDEL基序）及RFP标签融合，有亲和力的受体-结合蛋白配对可在内质网形成复合物，将受体截留在内质网以改变其亚细胞定位。该技术通过显微镜检查细胞荧光共定位分布即可判读筛选结果，可快速筛选正确折叠、溶解性好且有结合潜力的设计蛋白，有效规避了传统筛选方法需要大量纯化蛋白、受体蛋白生化性质要求高等缺陷。以分子表面共振（SPR）验证为基准，OPS-RD与传统酵母展示在有效结合预测性能对比中表现相当（ROC AUC=0.92），同时在5%的假发现率（FDR）阈值下对SPR验证阳性克隆有效报告率为75%，体现出优异的准确性与灵敏度，可作为靶点结合筛选的有效指标。

图2.OPS-RD平台的技术路线与验证

针对A类GPCR正构口袋的激动剂设计

作者首先选择瘙痒疼痛相关靶点MRGPRX1作为研究对象，采用MetaGen计算策略靶向受体活性态跨膜正构口袋，共生成13125个设计。经OPS-RD高通量筛选排序后，最终挑选91个设计进入体外验证，其中50个可在大肠杆菌中有效表达。钙动员实验筛选得到7个具有明确激动活性的设计，进一步浓度-反应分析鉴定出2个完全激动剂（EC₅₀分别为390 ± 70 nM和1000 ± 100 nM）和1个部分激动剂（EC₅₀为1400 ± 200 nM）。

为进一步优化激动剂亲和力，作者对上述三个激动剂进行关键位点饱和突变，并分别预测所有单/双/三突变体与MRGPRX1的结合自由能，筛选得到21个优化变体。其中最优变体mM1_034_F12W_Y27F的EC₅₀提升至42 ± 7 nM，与内源性BAMs活性相当。全组学GPCR筛选证实该变体脱靶活性极低，对MRGPRX1具有优异的受体选择性。

该设计策略同样被应用至另一疼痛相关A类GPCR靶点NK1R，分别使用RFdiffusion和MetaGen生成共计2.5万个设计，最终Rfdiffusion路线得到20个纳摩尔级亲和力的阳性克隆，而MetaGen策略未获得有效结果。部分设计包含近似内源性配体P物质的关键结合基序，提示自由设计对高亲和力配体的自发模拟。

图3.MRGPRX1/NK1R激动蛋白活性验证

为验证设计精确性，作者随后解析了激动剂mM1_060和mM1_068分别与MRGPRX1--miniGq形成三元复合物的冷冻电镜结构，两种激动剂的实际构象与设计模型Cα-RMSD仅为0.7 Å，同时激动剂结合位点均与BAM结合位点完全重叠，有力地验证了算法的设计精度。

图4.GPCR-激动剂复合物预测结构与电镜结构对比

A类GPCR正构口袋拮抗剂设计

为了验证设计方案是否能实现对GPCR构象的精准调控和下游效应控制，研究团队选择继续对正构口袋设计配体以锁定拮抗构象。作者使用酵母展示，以纳米盘稳定的受体蛋白为筛选靶标，分别针对三个具有临床意义的GPCR靶点开展设计筛选：与癌症、病毒感染相关的趋化因子受体CXCR4、CCR5，以及与神经精神疾病相关的催产素受体OXTR。三个靶点均成功获得纳摩尔级亲和力配体，但在下游结合效应上出现了有趣的差异：针对CXCR4筛选得到的最优拮抗剂 dCX1_001 IC₅₀达到24 ± 5 nM，无固有激动活性且靶点特异性优异；针对CCR5的筛选得到了中纳摩尔级拮抗剂，同时意外发现dCC1_002在cAMP和Gα解离实验中存在激动效应，而在微摩尔级浓度下促进β-arrestin1/2招募；OXTR设计经迭代扩散优化后获得亲和力231nM拮抗剂。

dCX1_001与CXCR4复合物的冷冻电镜结构（分辨率3.28 Å）数据支持了结合设计的高度准确性。dCX1_001的整体折叠与设计模型高度吻合，主链Cα均方根偏差仅0.6 Å，完全重现了设计预测的与受体ECL2的关键疏水相互作用；尽管受体最终构象与初始模板存在一定偏移，结合蛋白仍通过局部调整保留了70%的设计结合接触，界面残基突变实验也进一步验证了该结合模式的正确性。

图5.CXCR4拮抗剂设计与结构验证

针对B类GPCR ECD的拮抗剂设计

B类GPCR相较其他类型GPCR含有大的球形胞外结构域（ECD），大部分该家族成员通过ECD进行配体的特异性识别与结合。阻断ECD与内源性配体的结合可以有效拮抗受体信号转导，同时ECD区靶标大而易于单独可溶性表达，为配体设计与筛选降低了门槛。因此，作者团队针对B类GPCR设计ECD靶向拮抗剂，分别对胰高血糖素样肽1受体（GLP1R）、胃抑制多肽受体（GIPR）、胰高血糖素受体（GCGR）、降钙素基因相关肽受体（CGRPR）和甲状旁腺激素1受体（PTH1R）五个靶标开展设计，所有靶点均成功获得具有纳摩尔级亲和力的有效拮抗剂，其中GIPR所有功能拮抗剂均未对同源性极高的GLP1R与GCGR受体产生效应，展现优异的靶点特异性。

针对偏头痛相关异二聚体靶点CGRPR筛选获得的系列拮抗剂展现出优异的综合理化与生物物理性质，圆二色谱检测的二级结构特征与计算设计结果完全吻合，且均表现出高热稳定性；经定向界面优化得到的核心分子dC2_049为强效竞争性拮抗剂，可精准识别CLR-RAMP1异二聚体的特有表位，对CGRPR的同源相关受体家族无明显交叉反应，经Fc融合修饰后，分子体内半衰期从原生微型蛋白的0.4 h延长至25 h，体内清除率较原生状态下调200倍，满足长效体内给药的药代动力学要求。

团队进一步解析了dC2_049与dC2_050分别结合CGRPR的冷冻电镜结构，结合态微型蛋白与初始计算设计模型的骨架RMSD最低仅为0.5 Å，分子精准定位于内源配体αCGRP的C端胞外结合区域，通过直接的空间占位完全阻断内源配体的锚定通路，后续针对预测结合界面的关键残基开展定点突变实验，结果显示所有位点突变均完全消除分子的拮抗活性，从原子层面验证了从头设计的结合模式与预期一致，充分证明了胞外结构域靶向拮抗策略的结构可行性。

图6.B类GPCR ECD拮抗剂设计及结构验证

设计拮抗剂dCX1_001药理学性质验证

最后，为了确认从头设计GPCR调节剂的治疗潜力，研究人员选取CXCR4拮抗剂dCX1_001作为代表性案例开展体内药理学性质验证：依托CXCR4-CXCL12轴调控HSPCs在骨髓微环境中保留与迁移的生理机制，靶向阻断该通路可推动HSPCs动员至外周血用于采集与自体移植，是血液系统恶性肿瘤的经典临床治疗路径。在CD46转基因小鼠模型中开展的药效与耐受性评估显示，dCX1_001皮下给药后提升外周血LSK干细胞群与集落形成单位的HSPC动员疗效，与已获批用于非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤治疗的临床一线药物AMD3100（普乐沙福）相当。HDAd载体系统转导荧光报告基因显示，dCX1_001动员的基因修饰HSPCs可成功植入造血区室并实现长期造血重建，且表现出潜在的安全性优势：给药后诱导的外周血白细胞升高幅度更低，当前实验范围内未观测到AMD3100用药后常见的不良血液学效应与全身细胞因子水平升高表型。这提示了人工从头设计GPCR调节剂所具备的突出成药潜力。

图7.dCX1_001的药理学性质验证

总结

这项工作成功实现了靶向多个GPCR家族成员关键正构与深藏变构位点的功能调节剂从头设计，为膜蛋白复杂位点的结合蛋白精准设计提供了可靠的技术路线和筛选平台，并充分验证了从头蛋白配体设计体系的输出稳定性与可发掘性，展现了蛋白质从头设计的广阔应用前景；研究得到的高选择性迷你蛋白激动剂、拮抗剂与变构调节剂，为GPCR靶向生物药的开发提供了全新的候选分子模板与研发思路，也进一步鼓励相关领域研究者将该设计方法拓展到更多过去难以成药的复杂蛋白靶标，促进可成药靶点的版图拓展。

作者：李保宾组 唐莉晶