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Nature Communications|我院程田林/仇子龙/赵兴明合作,实现TadA重编程与高精度迷你碱基编辑器的开发

日期:2023-01-29 点击数: 来源:

2016年以来,哈佛大学David Liu实验室分别将胞嘧啶脱氨基酶APOBEC1蛋白及定向演化后的腺嘌呤脱氨酶TadA与CRISPR-Cas9系统融合,开发出了可实现C·G--T·A碱基对高效转换的胞嘧啶碱基编辑器(CBE)以及实现A·T--G·C碱基对高效转换的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)【1-2】。考虑到单碱基点突变在所有致病遗传变异中的占比超过60%【3】,CBE和ABE的出现极大推动了点突变功能研究和人类遗传病的治疗研究,也开启了碱基编辑器工具研发的热潮。

近年来研究者发现早期碱基编辑器存在多种缺陷与不足。其中两大核心问题是脱靶效应导致的安全风险和体积过大导致的体内递送困难。脱靶效应导致的安全风险方面,CBE特有的Cas非依赖型DNA脱靶风险尤为引人关注【4-5】。不过研究者发现,TadA突变体进行蛋白工程化改造可以让碱基编辑器ABE变身ACBE或CBE,这为降低甚至消除CBE特有的Cas非依赖型DNA脱靶风险提供了新思路【6-12】。体积过大导致的体内递送困难方面,传统碱基编辑器体积巨大的关键在于CRISPR-Cas9系统体积过大。近年来开发改造的迷你CRISPR-Cas12f系统为迷你碱基编辑器的开发奠定了基础【13-17】。

针对碱基编辑器的两大核心问题,复旦大学脑科学转化研究院程田林实验室、复旦大学类脑智能科学与技术研究院赵兴明实验室与中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心/上海交通大学医学院松江研究院仇子龙实验室合作,通过各类脱氨基酶与迷你CRISPR-Cas12f系统的组合筛选,首次开发出功能性的miniCBEs和具有全新活性窗口的miniABEs。此外,文章还对高活性脱氨基酶突变体TadA-8e的关键位点进行饱和突变筛选,实现了碱基编辑器ABE向ACBE和CBE的转变,并在此基础上开发出了具有兼具单碱基编辑精度和高安全性的miniCBEs工具。相关成果以TadA reprogramming to generate potent miniature base editors with high precision为题在Nature Communications杂志发表。

前期研究指出,腺嘌呤脱氨基酶TadA-8e与迷你CRISPR系统Cas12f组合可获得活性窗口为A3-A4的miniABEs【14】。本课题中,研究人员将TadA-8e及各类TadA突变体与Cas12f通过不同的融合等方式进行组合筛选,开发出一系列具有更高活性和编辑窗口多样性的miniABEs,其中C末端融合的CL-dRRAABE-TadA*(82G)具有全新的活性窗口A16-A17,这进一步拓展了miniABEs的应用场景(图1)。

图1 开发具有高编辑活性与编辑窗口多样的功能性miniABEs

目前为止,还未有研究团队能以Cas12f为基础开发出功能性的miniCBEs。为此研究者将代表性的胞嘧啶脱氨基酶突变体与Cas12f进行组合筛选,发现可构建出具有高编辑活性的miniCBEs(最高活性>30%)。然而胞嘧啶脱氨基酶衍生的miniCBEs难以兼具高编辑效率、高编辑精度和低脱靶风险,特别是Cas非依赖的DNA脱靶风险,因此需要新的策略加以改进。研究人员通过特定位点的饱和突变筛选发现,脱氨基酶TadA-8e可通过特定点突变组合进行重编程,从而实现碱基编辑器ABE向ACBE和CBE的转变,并有效降低甚至消除Cas非依赖的DNA脱靶风险。在此基础上,研究人员将重编程后的TadA-8e突变体与Cas12f组合,可构建出兼具高编辑效率、单碱基编辑精度和消除了Cas非依赖DNA脱靶风险的新型miniCBEs(图2)

图2 TadA-8e重编程后构建的新型miniCBEs

最后的应用探索研究中,研究团队成功利用新开发的miniABEs和miniCBEs在细胞模型中实现了致病点突变的高效修复,并利用AAV递送系统在小鼠大脑中实现了致病点突变的体内高效诱导,这证实了本研究开发的迷你碱基编辑器具有广阔的应用前景(图3)。

图3 迷你碱基编辑器miniABEs和miniCBEs的应用探索

综上所述,程田林/赵兴明/仇子龙团队合作开发出一系列新型迷你碱基编辑器miniABEs和miniCBEs,它们可通过单一AAV系统进行体内的有效递送和精准编辑,为碱基编辑器的体内应用提供了新利器。研究还证实,通过蛋白质工程化改造可实现TadA脱氨酶底物特异性的重编程,完成ABE向CBE和ACBE的转变并有效降低Cas非依赖的DNA脱靶效应。在此基础上开发的miniCBEs兼具高编辑活性、单碱基编辑精度和低脱靶风险等优势,并能通过单一AAV系统实现体内的有效递送和高效编辑。总体而言,本研究系统性探索了迷你碱基编辑器的开发策略,这对于迷你碱基编辑器的未来优化和改造具有非常重要的指导意义。

复旦大学脑科学转化研究院张淑倩博士、张成博士,中科院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)袁博博士,复旦大学类脑智能科学与技术研究院宋利婷博士、曹际新博士为该研究论文的共同第一作者。复旦大学脑科学转化研究院陈金龙博士、邱佳怡对本研究亦有重要贡献。本研究得到了复旦大学脑科学研究院邰一琳研究员,复旦大学类脑智能科学与技术研究院陈靖祺博士的大力支持。本研究在国家重点研发计划、国家自然科学基金、“求索”杰出青年计划、临港实验室、上海市科技重大项目和上海市自然科学基金的资助下完成。

程田林课题组目前有青年副研究员、特任副研究员和博士后的岗位,欢迎对基因编辑技术研发和脑疾病治疗感兴趣的科研人员/同学加入。申请人请将一份详细的个人完整简历(中英文皆可)通过电子邮件发送至chengtianlin@fudan.edu.cn,邮件标题请注明姓名+应聘职位。


原文链接:https://doi.org/10.1038/s41467-023-36004-2


参考文献:

  1. Komor, A., Kim, Y., Packer, M. et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016).

  2. Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).

  3. Rees HA, Liu DR. Base editing: Precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet,2018, 19: 770-788

  4. Zuo E, Sun Y, Wei W, Yuan T, et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 2019 Apr 19;364(6437):289-292.

  5. Jin S, Zong Y, Gao Q, et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 2019 Apr 19;364(6437):292-295.

  6. Liu, Z. et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nat Commun 9, 2338 (2018).

  7. Lee, H.K. et al. Targeting fidelity of adenine and cytosine base editors in mouse embryos. Nat Commun 9, 4804 (2018).

  8. Grunewald, J. et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nat Biotechnol 37, 1041-1048 (2019).

  9. Kim, H. S., Jeong, Y. K., Hur, J. K., Kim, J. S. & Bae, S. Adenine base editors catalyze cytosine conversions in human cells. Nat. Biotechnol. 37, 1145–1148 (2019).

  10. Jeong, Y.K., Lee, S., Hwang, GH. et al. Adenine base editor engineering reduces editing of bystander cytosines. Nat Biotechnol 39, 1426–1433 (2021).

  11. Chen, L., Zhu, B., Ru, G. et al. Re-engineering the adenine deaminase TadA-8e for efficient and specific CRISPR-based cytosine base editing. Nat Biotechnol (2022).

  12. Neugebauer, M.E., Hsu, A., Arbab, M. et al. Evolution of an adenine base editor into a small, efficient cytosine base editor with low off-target activity. Nat Biotechnol (2022).

  13. Kim, D.Y. et al. Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus. Nat. Biotechnol. 40, 94–102 (2021).

  14. Xu, X. S. et al. Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. Mol. Cell 81, 4333 (2021).

  15. Wu, Z. et al. Programmed genome editing by a miniature CRISPRCas12f nuclease. Nat. Chem. Biol. 17, 1132–1138 (2021).

  16. Bigelyte, G. et al. Miniature type V-F CRISPR-Cas nucleases enable targeted DNA modification in cells. Nat. Commun. 12, 6191 (2021).

  17. Karvelis, T. et al. PAM recognition by miniature CRISPR-Cas12f nucleases triggers programmable double-stranded DNA target cleavage. Nucleic Acids Res. 48, 5016–5023 (2020).


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