2023年09月07日，我院青年研究员袁鹏与美国耶鲁大学Grutzendler团队合作，于iScience在线发表文章“Single cell in vivo optogenetic stimulation by two-photon excitation fluorescence transfer”。该研究开发了一种新的方法，通过将荧光蛋白或者有机染料置于光遗传学通道附近的位置，随后使用双光子激发它们从而有效激活临近的光遗传学通道。该方法打破了现有双光子刺激效率所具有的局限性，为一些难以进行活体成像的实验提供了新的可能。

使用光敏感蛋白的光遗传学是神经生物学研究中的重要工具。一些经典的实验利用单光子照射大脑激活光敏感通道蛋白（ChR2等），可调控神经细胞的活动。虽然这种方法可以在时间上精确地操控细胞群体，但是沿着光路的所有细胞都会被激活，降低了空间特异性的同时还会导致人为造成的同步化活动。这些缺点都限制了光遗传学的应用，使其无法应用于调控单细胞精度下特定的细胞（如神经元）和其他的兴奋性细胞（如血管壁细胞及星形胶质细胞）。针对这一问题，基于双光子的光遗传学调控是提高空间精度的主要思路，而现有手段往往需要较高的刺激能量，限制了多细胞操控的活体应用。

在这项研究中，作者开发了一种稳定且实用的方法来实现活体单细胞精度的光遗传学调控，将其称为双光子激发荧光转移（two-photon excitation fluorescence transfer, TEFT）方法（图1）。TEFT通过双光子激发荧光基团，再由荧光激发光遗传通道，从而将双光子刺激转化为局部单光子点光源。作者提出了两个因素可能会影响TEFT的效率：第一，荧光基团最大的发射波长应该接近光遗传通道的最大吸收波长；第二，荧光基团的双光子吸收效率、量子效率以及光电流都应足够高。作者选择了tdTomato-ReaChR这一对作为示例，计算了荧光能量及TEFT的效率，表明基于TEFT的激发理论上足以激活光遗传离子通道。

图 1 TEFT技术的原理示意

根据上述原理，作者测试了在活体小鼠大脑中利用基于TEFT双光子光遗传学刺激血管壁细胞（vSMC）来控制局部脑血流的可行性。他们首先验证了Cspg4-Ai32小鼠诱导血管收缩的能力，这种小鼠的血管壁细胞可以表达兴奋性的ChR2，同时他们在血管中注射了蓝色荧光标记的白蛋白（cascade blue-conjugated albumin）并且使用800nm的激光扫描相关区域，观察到了强烈的血管收缩现象并且该现象出现的位置精确度很高。如果换成与ChR2吸收波长不匹配的蛋白或者是使用950nm的激光扫描则都不能观察到上述现象（图2）。总之，这些结果表明，双光子照射血管内染料可以对血管壁细胞进行高效且精准的光遗传学控制。

图 2 基于TFET技术实现活体单血管截段和单个神经元的光遗传学控制

在证明了使用TEFT可以对血管壁细胞进行有效控制后，作者接下来探索了将这种方法应用于神经元的可能性。为了探究光遗传学的效率，作者对急性小鼠脑切片中的锥体神经元（pyramidal neurons）进行了膜片钳记录。这些神经元表达ReaChR，记录的电极中则充满了Alexa594溶液，随后使用800nm波长的激光刺激整个细胞胞体。他们发现在相同的刺激条件下，有染料的细胞峰电流值比没有染料的要高出50%左右，此外TEFT介导的双光子刺激出现峰值的速度也要快于直接进行的双光子刺激。随后，作者又将该方法用在了活体小鼠大脑中，这些小鼠大脑中的神经元共表达tdTomato以及ReaChR，同时这些神经元中还表达有GCaMP6来检测神经元活动的变化。使用920nm波长的光进行激发，他们发现有tdTomato共表达的细胞可以使用低于ReaChR激活的激光能量完成刺激，这一结果说明，TEFT介导的双光子光遗传学控制提高了神经元的激活效率。

该研究改进了光遗传学调控的方法，而这一方法也将对单细胞精度下需要精确时空调控大脑的生理及神经网络的研究提供了技术基础。

袁鹏课题组在该研究中的工作受到上海市基础研究特区项目（21TQ1400100 (22TQ019)）、临港实验室“求索杰出青年计划”开放课题（LG-QS-202203-09）、上海市面上项目（22ZR1415000）的支持。本项目受到脑转化研究院舒友生教授的指导。

全文链接：https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(23)01934-X

袁鹏课题组长期致力于利用活体光学成像手段解读神经群体对于认知功能的编码，以及在脑疾病中神经编码的异常，主要研究成果发表在Nature、Nature Methods、Nature Communications、Neuron等学术杂志。课题组常年招聘对神经编码研究有兴趣的博士后及青年副研究员，待遇从优；志同道合的有志青年请联系：pyuan@fudan.edu.cn

课题组网站：https://itbr.fudan.edu.cn/info/1593/3134.htm

http://www.theyuanlab.net/

课题组近期代表工作：

1, PLD3 affects axonal spheroids and network defects in Alzheimer’s disease.Nature, 612(7939), 328-337, 2022.

2, RecV recombinase system for spatiotemporally controlled light-inducible genomic modifications.Nature Methods, 17: 422-429, 2020

3, Sex-specific life extension in tauopathy mice by CSF1R inhibition causing selective microglial depletion and suppressed pathogenesis.Nature Communications, 14: 118, 2023