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你是否曾在狂风骤雨中尝试捕捉闪电的瞬间？那一刹那的光芒，如同夜空的璀璨明星，却在你的眨眼间消失无踪。捕获这种瞬间的美，需要无比的耐心和精准的把握时机。神经元，它们通过电压的变化来传递信息。当你阅读这段文字，聆听音乐，或是感受到触碰，你的神经元便在疾速且不断地变化电压。这些电压的变化，就像是在你的大脑深处闪烁的“闪电”，照亮了你的思想、感觉和行动。

引言

膜电位变化是神经元活动的基础信号。钙成像原理是通过钙离子指示剂来反映细胞内钙离子浓度的变化，间接显示动作电位。而电压成像则利用电压敏感的荧光指示剂直接标记膜电位变化，再通过光学成像手段将其以图像形式记录下来，因此，它能检测到阈下电活动。基因编码电压指示剂(Genetically encoded voltage indicators, GEVIs)[1]能够特异性的靶向细胞和蛋白，标记损伤小，可终身表达，使活体长时间电压成像成为可能。然而，GEVIs成像对荧光显微镜提出了两个关键性挑战：

1.快速成像：动作电位和其他形式的膜电压变化通常在毫秒级时间尺度上发生，因此，成像系统需要达到近千赫兹的成像帧率；

2.弱信号检测：电压指示剂必须定位到细胞膜上才能发挥作用，而细胞膜的体积相对于细胞的内外部来说非常小，因此，可以采集到有效信号的荧光分子数量有限。因此，有效的电压成像需要一种能在近千赫帧率下提供高信噪比测量的成像系统。

2023年8月21日，美国波士顿大学Michael N. Economo课题组在《Nature Neuroscience》上发表了一篇题为《High-speed multiplane confocal microscopy for voltage imaging in densely labeled neuronal populations》的文章[2]。他们基于共聚焦显微镜技术，开发了一种名为MuZIC的高速多平面电压成像系统，以近千赫兹的成像帧率，成功实现了密集标记的神经元群体的电压成像。

多平面共聚焦电压成像技术

图1

MuZIC (Multi-Z imaging with confocal detection)旨在实现电压荧光指示剂的千赫兹帧率成像，该技术在高速多边形扫描器的帮助下，实现了117kHz的线扫描速率，并通过多个轴向分布的小孔进行高效率的荧光收集和检测，使得在150×150×45um³的体积内实现多平面成像(图1a, b)。作者首先在含有膜结合荧光蛋白的鼠脑切片上验证了这项技术。与宽场成像相比，MuZIC显著降低了背景荧光(图1c)，从而能够提供更清晰的神经结构图像。

MuZIC离体高精度电压成像

图2

为了进一步验证MuZIC技术的效果，作者在体外急性脑片上同时进行全细胞电生理记录和MuZIC成像。在密集标记的样本中，MuZIC成像能够清晰地分辨出横跨四个焦平面的30至40个神经元(图1d)。MuZIC可以检测到胞内电流注入诱导的动作电位和亚阈值电压波动，并在多次实验的平均结果中，观察到膜电位的微小亚阈值变化(图2a,b)。同时，作者们还发现膜电位变化与荧光之间存在一种线性关系，这种关系在不同神经元中都保持一致(图2c,d)。

MuZIC活体电压成像

图3

为了进一步探索MuZIC技术的潜力，作者对小鼠的运动皮层神经元进行了密集标记，以探索在活体条件下的电压成像。研究结果表明，尽管在传统宽场成像下，大多数单个细胞无法被清晰地分辨出来，但在MuZIC技术的帮助下，这些细胞能被高对比度地观察到(图3a)。更进一步，在神经活动的检测中，MuZIC在清醒小鼠中进行的体内成像揭示了多个神经元自发动作电位的荧光瞬变，以及它们的亚阈值电压动态(图3b)。另外，活体条件下多平面电压成像的有效性也得到了验证(图3c)。

MuZIC技术与成像深度的关系

图4

作者继续探究了MuZIC技术与成像深度之间的关系(图4a)。在恒定的光功率照明下，他们测量并统计了一组细胞的平均荧光强度、图像对比度、尖峰信噪比以及光漂白率，并进行了量化分析(这些细胞距离皮层表面51-215微米，图4b左侧)。根据数据拟合结果，他们发现成像深度每增加100 um，尖峰信噪比就会下降30%，而这种下降主要是由于荧光强度的减弱，而非图像对比度的显著下降。同时，光漂白速率也随着深度的增加而下降，这表明聚焦点的激发功率由于生物组织沿光束路径的吸收和散射而减小。

MuZIC结合植入式微型棱镜深层成像

图5

作者们进一步将MuZIC技术与植入的反射微棱镜结合使用，这种结合使他们能够在皮层各层实现同时活体成像(图5)，甚至首次揭示了皮层深层Layer 5b锥体神经元的电压动力学特性(图5b、c)。虽然通过高折射率颅窗和植入式光学元件进行成像会导致球面像差，但即使没有像差矫正，MuZIC仍然能清晰地分辨神经元细胞体及其近端树突(图5b)。

同时电压成像与光遗传刺激

图6

借助MuZIC技术，作者们实现了无光学伪影的全光生理学研究，他们在一组皮层神经元中共表达光遗传激活剂ChR2和电压指示剂Voltron2-ST_JF585，并施加蓝光刺激，以便同时控制和记录神经活动(图6a)。整个神经元群体中的动作电位和亚阈值去极化都能容易地被检测到(图6b)，并且持续的蓝光刺激可在双重标记的神经元中诱发无光学伪影的亚阈值去极化和动作电位串(图6b)。短暂的蓝光刺激在部分试验中引起具有可变潜伏期的动作电位，并在其余试验中引发亚阈值去极化(图6c、d)。不仅如此，对光遗传刺激作出电压响应的一些微妙特征，如动作电位后的超极化，也可以通过光学方法追踪(图6c、d)。

总结

本研究开发了一种名为MuZIC的多Z轴共聚焦成像系统，它能够以近千赫兹的帧率进行高效、高对比度的GEVIs成像。MuZIC的应用在小鼠新皮层的离体和活体成像中得到了展示，它使得在密集标记的神经元群体中实现高信噪比电压成像成为可能，并且与微光学成像技术具有良好的兼容性。此外，MuZIC还最大限度地减少了全光学电生理学中并发成像和光遗传光刺激相关的伪影问题。MuZIC将成为研究体外和体内神经回路功能的有价值工具，特别是在需要高速、高对比度和体积成像的电压成像应用中。

参考文献：

[1] Abdelfattah, A. S. et al. Sensitivity optimization of a rhodopsin-based fluorescent voltage indicator. Neuron 111, 1547–1563 (2023).

[2] Timothy D. Weber et al. High-speed multiplane confocal microscopy for voltage imaging in densely labeled neuronal populations. Nature Neuroscience 26, 1642-1650 (2023).

本文作者：李博组刘守佩